植物干細胞生物合成技術(shù)-推動(dòng)植物源生物農藥產(chǎn)業(yè)高速發(fā)展（植物生物技術(shù)在農業(yè)領(lǐng)域的應用）  分享

植物中富含碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪等營(yíng)養物質(zhì)，同時(shí)也含有大量次生代謝產(chǎn)物。其在藥品、香料、染料、色素、殺蟲(chóng)劑、食品添加劑等領(lǐng)域具有悠久的應用歷史[1]。長(cháng)期以來(lái)，植物資源己經(jīng)成為人類(lèi)賴(lài)以生存的食物與藥品的重要資源之一。植物次生代謝產(chǎn)物是植物體中存在的一大類(lèi)非生長(cháng)發(fā)育所必需的小分子有機化合物，但在植物抗逆及抵御病蟲(chóng)害等方面發(fā)揮著(zhù)重要作用。

目前已報道的植物次生代謝產(chǎn)物主要包括生物堿、黃酮類(lèi)、醛類(lèi)、木脂素等，其種類(lèi)達到數萬(wàn)種以上。目前，部分次級代謝產(chǎn)物已被開(kāi)發(fā)成商業(yè)化產(chǎn)品，具有廣闊的社會(huì )需求與重要的應用價(jià)值。例如，青蒿素被用于痢疾的治療，紫草素用于抗菌，香蘭醛、玫瑰油用作香料，除蟲(chóng)菊素、苦參堿、藜蘆堿用作殺蟲(chóng)劑，蛇床子素、香芹酚、小檗堿等已被廣泛用于農業(yè)病害的防治。

隨著(zhù)對新品類(lèi)藥用植物的研究以及先進(jìn)技術(shù)的投入，越來(lái)越多的具有高生物活性的新型藥用植物次生代謝產(chǎn)物相繼被發(fā)現，對植物資源的需求正不斷增加。除野生采集外，藥用植物的人工栽培仍是目前提供原材料的主要途徑。人工栽培對植物種子、土壤、氣候條件等要求較高，栽培過(guò)程中易感染病害、部分藥用植物栽培時(shí)間長(cháng)、管理成本高。同時(shí)，藥用植物栽培與農作物栽培的爭地矛盾日益突出[1]，高活性植物次生代謝產(chǎn)物供需關(guān)系緊張[2]。

而利用植物干細胞生物反應技術(shù)對經(jīng)誘導生成的植物單細胞進(jìn)行大規模集中離體飼喂，以大量獲得高活性目標代謝產(chǎn)物是目前解決藥用植物資源問(wèn)題的有效途徑。

一、植物干細胞概念及發(fā)展

植物組織培養與細胞培養開(kāi)始于19世紀后半葉，在Schleiden和Schwann創(chuàng )立的細胞學(xué)說(shuō)基礎上，1902年德國植物生理學(xué)家Habedandt提出了著(zhù)名的″植物干細胞全能性″論點(diǎn)[3]，認為植物干細胞具有在體外發(fā)育成完整植株的能力。但直到1934年，White[4]使用離體的番茄根部建立了第一個(gè)活躍生長(cháng)的無(wú)性系，才使根的離體培養試驗首次獲得了真正的成功。二十三年后，Skoog和Miller[5]發(fā)現，激動(dòng)素可以有效地促進(jìn)外植體的細胞分裂和芽再生。其中最重要的是，高激動(dòng)素/生長(cháng)素比例誘導芽的發(fā)生而低激動(dòng)素/生長(cháng)素比例促進(jìn)根的發(fā)生。這一發(fā)現奠定了植物組織培養中再生和細胞工程的基礎，揭開(kāi)了激素調控植物器官再生的秘密面紗。Muir等人[6]利用萬(wàn)壽菊愈傷組織建立了首個(gè)植物干細胞懸浮系。他們通過(guò)愈傷組織哺育方法成功地觀(guān)察到單個(gè)細胞可以分裂形成小的細胞團。1958年，Steward等人[7]將胡蘿卜根韌皮部的細胞進(jìn)行離體培養，發(fā)現這些細胞失去已分化細胞的結構特征并發(fā)生反復的細胞分裂，最終形成胚胎并發(fā)育成具有根、莖、葉等器官的完整植株。同年，德國科學(xué)家Reinert[8-9]也獲得了類(lèi)似的研究結果。此后，經(jīng)過(guò)研究人員50余年的不斷驗證，植物干細胞的全能性已經(jīng)得到充分驗證。

圖1. 不同品種的植物干細胞

二、植物干細胞生物反應技術(shù)

與常規的栽培技術(shù)相比，植物組織和細胞培養進(jìn)行藥用植物目標次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)具有顯著(zhù)的優(yōu)越性。[10]與栽培植物不同，植物干細胞生物反應技術(shù)使用工業(yè)化反應器生產(chǎn)系統及配套回收工藝，在自動(dòng)控制系統的加持下，可實(shí)現全年不間斷運轉。不受土壤環(huán)境、氣候條件、生物及非生物脅迫的影響。全培養周期無(wú)菌環(huán)境控制，無(wú)需使用農藥防治病蟲(chóng)草害的侵擾。同時(shí)，植物干細胞生物反應所供給的基礎營(yíng)養成分價(jià)格低廉，與哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、酵母細胞培養體系相比，成本效益更加顯著(zhù)。

在作為生物合成底盤(pán)細胞方面，植物干細胞合成植物源天然代謝產(chǎn)物具有先天的優(yōu)勢。與細菌不同，植物干細胞作為真核系統，它們具有正確折疊和組裝多聚體蛋白質(zhì)的能力。此外，植物干細胞能夠進(jìn)行在許多原核生物中很少發(fā)生的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，為生物合成通路調節增添了更多可能性。植物干細胞在對目標產(chǎn)物進(jìn)行生物合成時(shí)，不會(huì )產(chǎn)生細菌毒素，合成系統安全性更高。另外，植物干細胞包含復雜的內膜，能夠順利表達需定位于質(zhì)體系統的原生生物合成過(guò)程關(guān)鍵蛋白酶。

表1. 不同生物合成底盤(pán)情況對比

植物細胞遺傳轉化方法成熟穩定，隨著(zhù)新基因編輯工具的發(fā)展，異源基因的表達調控不再困難。通過(guò)對代謝途徑的研究，實(shí)現對目標產(chǎn)物生物合成路線(xiàn)關(guān)鍵基因、限速酶進(jìn)行遺傳操作，提高目標產(chǎn)物生物合成量。亦可利用基因工程技術(shù)探索或人工創(chuàng )造全新生物合成路線(xiàn)，獲得本底細胞地盤(pán)品種不具備合成能力的其他目標代謝產(chǎn)物。將底盤(pán)細胞的優(yōu)勢及目標代謝產(chǎn)物合成能力相結合，大幅提升產(chǎn)量。同時(shí)，通過(guò)生物反應轉化作用，能夠將價(jià)值較低的前體物質(zhì)轉化為高價(jià)值目標產(chǎn)物。植物干細胞生物反應技術(shù)作為解決資源問(wèn)題的有效途徑而成為了當代生物技術(shù)的重要發(fā)展領(lǐng)域之一。

圖2. 植物干細胞生物反應

作為生物合成底盤(pán)，植物干細胞展現出了其獨有的優(yōu)勢。轉基因或基因編輯工程細胞并非完整的植株品種，面臨更少的法規監管上問(wèn)題。但是，非模式植物原生干細胞獲取具有不確定性，高度復雜的代謝網(wǎng)絡(luò )調控機制也給生物合成工作帶來(lái)了前所未有的挑戰。

表2. 植物干細胞生物催化合成案例[13]

三、植物毛狀根生物反應技術(shù)

植物材料生物反應工廠(chǎng)中最常用的生產(chǎn)系統是干細胞懸浮培養。然而，在特殊情況下，未分化的組織中可能無(wú)法產(chǎn)生某些特定次生代謝產(chǎn)物，或某些植物次生代謝產(chǎn)物的合成高度依賴(lài)于特定的組織器官時(shí)，毛狀根生物反應技術(shù)提供了另一種解決方案。毛狀根生物反應技術(shù)是利用發(fā)根農桿菌浸染植物，使植物產(chǎn)生毛狀根。

圖3. 植物毛狀根生物反應

該技術(shù)不需外源生長(cháng)調節劑和額外光源，生長(cháng)迅速、分支多、特定次生代謝物質(zhì)含量遠高于細胞懸浮培養含量。毛狀根生物反應同樣也受營(yíng)養成分、誘導子、前體和基因操作等因素的影響，是目前被認為最好的獲得植物次生代謝產(chǎn)物的原材料之一。

表3. 植物毛狀根生物催化合成案例[13]

目前，使用毛狀根生物反應技術(shù)作為生物合成轉化的適合材料，正在獲得超越植物干細胞培生物反應的優(yōu)勢。它們具有許多優(yōu)點(diǎn)，包括生化和遺傳穩定性、對培養條件變化的敏感性較低、酶潛力與親本植物非常相似和低成本。

四、植物干細胞培養發(fā)展現狀與研究進(jìn)展

1. 全球產(chǎn)業(yè)化現狀

多年來(lái)，通過(guò)植物干細胞生物反應技術(shù)生產(chǎn)藥用成分取得了很大的進(jìn)展。目前已經(jīng)研究過(guò)的植物有400多種，能夠生產(chǎn)超過(guò)600多種的初級、次級代謝成分，其中有相當大部分具有藥用價(jià)值，部分已成功實(shí)現工業(yè)化生產(chǎn)。早在1956年，美國Routier和Nickell就提出了從植物干細胞培養合成天然產(chǎn)物的專(zhuān)利[10]。日本三井石油化工公司于1983年宣布將紫草寧作為染料和藥物進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，此外，從毛地黃細胞培養物通過(guò)生物轉化生產(chǎn)地高辛，黃連細胞培養物生產(chǎn)黃連堿，人參根培養生產(chǎn)人參皂苷等均實(shí)現了工業(yè)化生產(chǎn)。其他如長(cháng)春花和彩葉紫蘇等細胞培養，也達到中試水平[12]。通過(guò)紅豆杉干細胞培養技術(shù)，紫杉醇生物合成量達到了1045mg/L,較親本植株提升超過(guò)298倍。積雪草總苷類(lèi)合成量達到1670mg/g DW,已完全滿(mǎn)足產(chǎn)業(yè)化需求。比利時(shí)Green2chem公司以及法國Naturex等公司積極利用植物毛狀根生物反應技術(shù)，成功實(shí)現了諸如煙堿、西利馬林、紫杉醇、奎寧、佛司可林等20余種高價(jià)值藥用成分的生物合成。在中國，紐蘭生物將植物細胞微囊泡作為藥物遞送介質(zhì)開(kāi)展研究，截至2018年，該公司完成了天使輪融資，已建成噸級以上植物干細胞生物反應設備。2022年初，美國Phyton公司投資30億元在徐州開(kāi)工建設PCF植物干細胞生物反應″超級工廠(chǎng)″，建成后預計銷(xiāo)售收入達70億元。

2. 生物合成助推植物源農藥產(chǎn)業(yè)高速發(fā)展

不積跬步，無(wú)以至千里。成都新朝陽(yáng)作物科學(xué)股份有限公司（以下簡(jiǎn)稱(chēng)″新朝陽(yáng)″）成立二十余年來(lái)，始終專(zhuān)注于農業(yè)綠色發(fā)展，是行業(yè)領(lǐng)先的植物源生物農藥科技企業(yè)。植物源農藥有效成分多為天然高活性次級代謝產(chǎn)物，其具有降解速度快、環(huán)境相容性好、低殘留等特點(diǎn)，符合當下環(huán)保發(fā)展潮流，市場(chǎng)需求量持續增長(cháng)。但隨著(zhù)產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程的推進(jìn)，藥用植物資源問(wèn)題即將成為高活性天然產(chǎn)物運用的技術(shù)瓶頸。

圖4. 植物干細胞生物反應技術(shù)基礎路線(xiàn)

新朝陽(yáng)公司通過(guò)愈傷組織誘導，植物干細胞懸浮培養，毛狀根誘導等植物干細胞培養技術(shù)，開(kāi)展植物干細胞生物反應技術(shù)研究，目前已獲得重要進(jìn)展。

圖5. 基因工程植物干細胞生物反應階段性成果

新朝陽(yáng)通過(guò)植物組織干細胞誘導技術(shù)，目前已獲得超過(guò)10余種具有生物合成開(kāi)發(fā)潛力的植物底盤(pán)細胞材料。經(jīng)過(guò)生物反應條件優(yōu)化，目前干細胞產(chǎn)量已達到550g/L。通過(guò)基因工程技術(shù)，成功實(shí)現了目標代謝產(chǎn)物的底盤(pán)異源表達，完成了多個(gè)工程細胞的代謝通路關(guān)鍵基因重組構建。并成功實(shí)現了目標代謝產(chǎn)物的生物合成小試技術(shù)研究。為目標天然產(chǎn)物品種產(chǎn)業(yè)化技術(shù)目標推進(jìn)頂定了堅實(shí)基礎。

五、植物干細胞生物反應技術(shù)展望  

長(cháng)期對珍稀藥用植物的盲目采集致使生態(tài)環(huán)境遭到破壞，許多野生植物瀕臨滅絕，一些特殊生態(tài)環(huán)境下的植物引種困難，能夠引種栽培的植物則需要占用大量的農田，在耕地面積日益減少及保證18億畝耕地紅線(xiàn)的制約情況下，藥用植物的大規模種植受到嚴重制約。此外，人工栽培受環(huán)境因素的制約，天然植株中目的次生代謝產(chǎn)物含量過(guò)低，成分復雜又給產(chǎn)業(yè)化利用構建了極高的開(kāi)發(fā)成本壁壘。天然高活性藥用產(chǎn)物結構復雜，手性中心數量多，傳統化學(xué)合成技術(shù)已無(wú)法滿(mǎn)足生產(chǎn)技術(shù)需求。面對上述諸多難題，科學(xué)工作者通過(guò)探索高等植物干細胞、器官等的大量培養技術(shù)，生產(chǎn)有用的次生代謝產(chǎn)物[14-16]，具有極大的社會(huì )意義。

據《中國植物源農藥行業(yè)競爭現狀分析及企業(yè)投資策略研究報告》顯示，中國是全球農藥生產(chǎn)和使用大國，而生物農藥（含農用抗生素）占農藥總量的比例不足12.5%，遠低于國際平均水平。生物農藥受?chē)艺咧С?，符合當下環(huán)保消費潮流，市場(chǎng)增速快。植物源農藥作為生物農藥的關(guān)鍵種類(lèi)，具備廣闊的發(fā)展前景。

新朝陽(yáng)作為一家從事原創(chuàng )生物技術(shù)研發(fā)的生物農藥科技企業(yè)，通過(guò)植物干細胞生物反應技術(shù)的創(chuàng )新突破，致力于解決植物源農藥產(chǎn)業(yè)化的瓶頸，為保護生態(tài)環(huán)境和促進(jìn)農業(yè)綠色發(fā)展做出貢獻。未來(lái)，新朝陽(yáng)持續以作物為科研導向，持續提升植物源農藥的防治效果和降低應用成本，推動(dòng)植物源農藥產(chǎn)業(yè)高速發(fā)展。

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